體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)原理及注意事項(xiàng)

體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)在化合物遺傳毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用日益廣泛。ICH S2(R1)已將肝臟彗星試驗(yàn)列為第2個(gè)組織/終點(diǎn)的體內(nèi)試驗(yàn)；體內(nèi)哺乳動(dòng)物堿性彗星試驗(yàn)的指導(dǎo)原則（TG489）也已頒布。體內(nèi)堿性彗星實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)DNA鏈斷裂、堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)、不完整切除修復(fù)引起的DNA鏈的斷裂，能夠制成合適細(xì)胞懸液的組織DNA損傷。與其他試驗(yàn)相比其檢測(cè)的是單細(xì)胞水平的DNA損傷，因此該試驗(yàn)敏感性較高，操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)省時(shí)。

實(shí)驗(yàn)原理

彗星實(shí)驗(yàn)（comet assay）也稱單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（single cell gel electrophoresis.SCGE）,是一種有效評(píng)估DNA損傷的方法。其原理是器官或組織經(jīng)處理（如輻射、重金屬等）后，細(xì)胞中的DNA發(fā)生單鏈或雙鏈斷裂，經(jīng)細(xì)胞及其核膜裂解后，DNA解旋，在電場(chǎng)作用下，DNA 斷片遷移出細(xì)胞核，形成彗星狀的電泳圖譜。正常細(xì)胞的大分子DNA在電場(chǎng)作用下遷移距離較短，DNA仍保留在細(xì)胞核的范圍，形成圓形或輕微拖尾的圖譜。根據(jù)電泳緩沖液的pH值不同，可分為中性彗星實(shí)驗(yàn)（pH=8.4）和堿性彗星實(shí)驗(yàn)（pH＞13）。中性彗星實(shí)驗(yàn)主要用于檢測(cè)DNA雙鏈的斷裂損傷，堿性彗星實(shí)驗(yàn)具有更高的靈敏性，可用于檢測(cè)更少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷。

需要注意的是，試驗(yàn)過(guò)程中的個(gè)方面，包括樣品準(zhǔn)備、電泳條件、視覺分析參數(shù)(如染色強(qiáng)度、顯微鏡光強(qiáng)度以及使用顯微鏡濾鏡和相機(jī)動(dòng)態(tài)和環(huán)境條件(如背景照明)已經(jīng)被研究，可能影響DNA遷移。

圖一：DNA損傷彗星細(xì)胞

圖二：正常細(xì)胞

堿性彗星實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則

TG489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay，2016，OECD Guideline for the Testing of Chemicals

試驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)證明能夠?yàn)樗褂玫哪繕?biāo)組織獲得足夠質(zhì)量的單細(xì)胞或細(xì)胞懸浮液，從而在彗星試驗(yàn)（comet assay）中建立實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Α?/font>匯智泰康擁有多年毒理學(xué)服務(wù)與產(chǎn)品研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)不同遺傳毒性試驗(yàn)開發(fā)針對(duì)試劑盒，包括彗星試驗(yàn)試劑盒。首先通過(guò)%尾DNA的評(píng)價(jià)，對(duì)照處理組動(dòng)物%尾DNA在低范圍內(nèi)。目前的數(shù)據(jù)表明,尾部DNA百分比(基于平均中位數(shù))在大鼠肝臟應(yīng)該hao不要超過(guò)6%,這將是符合JaCVAM驗(yàn)證試驗(yàn)的值和其他出版和私有數(shù)據(jù)。目前還沒有足夠的數(shù)據(jù)對(duì)其他組織的jia或可接受范圍提出建議。這并不排除合理使用其他組織。測(cè)試報(bào)告應(yīng)根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)或?qū)Ｓ袛?shù)據(jù)，對(duì)彗星試驗(yàn)在這些組織中的性能進(jìn)行適當(dāng)?shù)膶彶?。首先，在?duì)照組中，需要一個(gè)較低的%尾DNA范圍，以提供足夠的動(dòng)態(tài)范圍來(lái)檢測(cè)陽(yáng)性的影響。其次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)能夠按照表1所建議的不同方式，對(duì)直接誘變劑和促進(jìn)劑的反應(yīng)。

表一：陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)及其部分靶組織

應(yīng)收集陰性對(duì)照數(shù)據(jù)，以證明陰性數(shù)據(jù)反應(yīng)的再現(xiàn)性，并確保對(duì)檢測(cè)的技術(shù)方面進(jìn)行適當(dāng)控制，或建議需要重新建立歷史控制范圍。

歷史對(duì)照

在實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立歷史數(shù)據(jù)庫(kù)，建立相關(guān)組織和物種的陽(yáng)性和陰性對(duì)照范圍和分布。不同的組織和不同的物種，以及不同的給藥溶媒和給藥途徑，可能會(huì)產(chǎn)生不同的%尾DNA陰性對(duì)照值。因此，建立每個(gè)組織和物種的陰性對(duì)照范圍是很重要的。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采用質(zhì)量控制方法，以確定其數(shù)據(jù)的變化程度，并表明該方法在其實(shí)驗(yàn)室中得到了“控制”。可能還需要優(yōu)化選擇適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照物質(zhì)、劑量范圍和實(shí)驗(yàn)條件(例如電泳條件)，以便發(fā)現(xiàn)微弱的影響。

對(duì)實(shí)驗(yàn)方案的任何更改都應(yīng)根據(jù)其與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有歷史控制數(shù)據(jù)庫(kù)的一致性加以考慮。任何重大的不一致都應(yīng)導(dǎo)致建立新的歷史控制數(shù)據(jù)庫(kù)。

方法描述

動(dòng)物選擇：通常使用健康成年嚙齒動(dòng)物(6-10周齡，但年齡稍大的動(dòng)物也可接受)。然而，如果合乎倫理和科學(xué)，其他物種也可以被利用。

動(dòng)物準(zhǔn)備：動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。在開始實(shí)驗(yàn)前，這些動(dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件至少5天，給予標(biāo)識(shí)識(shí)別。試驗(yàn)開始時(shí),動(dòng)物的重量差異應(yīng)該不超過(guò)±20%。

樣品制備：在給動(dòng)物給藥前，固體測(cè)試化學(xué)品應(yīng)溶解或懸浮在適當(dāng)?shù)?/font>溶媒中，或混合在飲食或飲用水中。液體試驗(yàn)化學(xué)品可直接加藥或在加藥前稀釋。對(duì)于吸入暴露，根據(jù)其物理化學(xué)性質(zhì)，試驗(yàn)化學(xué)品可以作為氣體、蒸汽或固體/液體氣溶膠使用。

溶媒：在使用的劑量范圍內(nèi)，溶媒不應(yīng)產(chǎn)生毒性作用，也不應(yīng)與試驗(yàn)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。如果使用的不是常用溶媒應(yīng)提供參考數(shù)據(jù)，說(shuō)明它們?cè)跍y(cè)試動(dòng)物、管理路線和終點(diǎn)方面的兼容性。建議在可能的情況下，應(yīng)首先考慮使用水性溶劑/溶媒。值得注意的是，一些溶劑可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，增加接觸部位DNA鏈斷裂的背景水平，尤其是與多藥給藥時(shí)。

陰性對(duì)照：陰性對(duì)照動(dòng)物，單獨(dú)用溶媒處理，其他處理方法與治療組相同，每一次采樣時(shí)間和組織的每次檢測(cè)均納入一組陰性對(duì)照動(dòng)物。陰性對(duì)照動(dòng)物的尾部DNA應(yīng)在每個(gè)組織預(yù)先設(shè)定的實(shí)驗(yàn)室背景范圍和該物種的取樣時(shí)間內(nèi)。

動(dòng)物數(shù)量和性別：目標(biāo)是每組提供至少5只可分析的單性別動(dòng)物，或如果使用兩種動(dòng)物，則每組至少提供5只可分析的單性別動(dòng)物。如果人類接觸到的化學(xué)物質(zhì)可能具有性別特異性，例如某些藥物，則應(yīng)在適當(dāng)?shù)男詣e下進(jìn)行檢測(cè)。三個(gè)劑量組和同時(shí)進(jìn)行的陰性和陽(yáng)性對(duì)照(每一組由5只單性別動(dòng)物組成)，將需要25至35只動(dòng)物。

試驗(yàn)計(jì)劃：動(dòng)物應(yīng)接受為期2天或以上的每日給藥(即每隔約24小時(shí)進(jìn)行兩次或兩次以上)，并在后一次治療后的2-6小時(shí)采集一次樣本。延長(zhǎng)劑量方案(如28天每日給藥)的樣本是可以接受的。測(cè)試化學(xué)品也可以分次使用，即，兩組給藥在同一天間隔不超過(guò)2-3小時(shí)，便于給藥量大。在這種情況下，取樣時(shí)間應(yīng)根據(jù)后一次給藥的時(shí)間來(lái)安排。

劑量水平：對(duì)無(wú)毒試驗(yàn)化學(xué)品，給藥14天以上的，大(限)劑量為1000mg /kg體重/天。給藥時(shí)間少于14天，gao劑量為2000毫克/公斤體重/天。對(duì)于特定法規(guī)所涵蓋的特定類型的測(cè)試化學(xué)品(如人類藥物)，這些限制可能有所不同。在長(zhǎng)期給藥后表現(xiàn)出毒物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)飽和或誘導(dǎo)排毒過(guò)程而可能導(dǎo)致接觸減少的物質(zhì)，可能是劑量設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的例外，應(yīng)逐個(gè)進(jìn)行評(píng)估。

急性和亞急性的彗星試驗(yàn),除了大劑量(MTD,大可行的劑量,大接觸或限制劑量)遞減序列至少兩個(gè)額外的適當(dāng)間隔的劑量水平(hao相隔不到√10)應(yīng)該選擇為每個(gè)采樣時(shí)間證明劑量相關(guān)的反應(yīng)。但是，所使用的劑量水平也hao包括從大限度到產(chǎn)生很少或沒有毒性的劑量范圍。當(dāng)檢測(cè)到所有劑量水平的靶組織毒性時(shí)，建議進(jìn)一步進(jìn)行無(wú)毒劑量的研究。為了更全面地調(diào)查劑量-反應(yīng)曲線的形狀，可能需要進(jìn)行研究。

在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮人體接觸的預(yù)期途徑。因此，暴露途徑，如飲食、飲水、局部、皮下、靜脈、口服(灌胃)、吸入、氣管內(nèi)或植入術(shù)可能是合理的。無(wú)論如何，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)穆窂揭源_保目標(biāo)組織得到充分暴露。腹腔注射通常不推薦使用，因?yàn)樗皇堑湫偷娜梭w接觸的相關(guān)途徑，只能在有特定理由的情況下使用(例如，一些陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)，用于調(diào)查目的，或用于腹腔注射途徑所使用的某些藥物)。一次灌胃或注射液體的大容量取決于試驗(yàn)動(dòng)物的大小。體積不應(yīng)超過(guò)1毫升/100克體重，但可使用2毫升/100克體重的水溶液除外。如果動(dòng)物福利立法允許，使用比這更多的量是合理的。在可能的情況下，應(yīng)通過(guò)調(diào)整劑量配方的濃度來(lái)達(dá)到不同的劑量水平，以確保在所有劑量水平上的體積相對(duì)于體重是恒定的。

采樣時(shí)間：采樣時(shí)間是一個(gè)關(guān)鍵變量，因?yàn)樗怯蓽y(cè)試化學(xué)物質(zhì)在目標(biāo)組織中達(dá)到大濃度所需的時(shí)間和DNA鏈斷裂的誘導(dǎo)時(shí)間決定的，但在這些斷裂被移除、修復(fù)或?qū)е录?xì)胞死亡之前。彗星實(shí)驗(yàn)（comet assay）檢測(cè)到的一些導(dǎo)致DNA鏈斷裂的損傷持續(xù)時(shí)間可能很短，至少對(duì)于一些體外測(cè)試的物質(zhì)來(lái)說(shuō)是這樣。因此，如果懷疑這種短暫的DNA損傷，應(yīng)采取措施減輕其損失，確保組織得到足夠早的采樣，可能早于下面給出的默認(rèn)時(shí)間。jia采樣時(shí)間可能是特定于物質(zhì)或路徑的采樣時(shí)間，例如，靜脈給藥或吸入給藥導(dǎo)致組織快速暴露。因此，在可能的情況下，應(yīng)根據(jù)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(如血漿或組織濃度達(dá)到峰值的時(shí)間(Tmax)或多次給藥的穩(wěn)態(tài)時(shí)間(Cmax)確定采樣時(shí)間。在缺乏動(dòng)能的測(cè)量數(shù)據(jù)合適的妥協(xié)基因毒性是樣品2-6 h后給藥兩次或兩次以上,或2-6和第16 - 26 h后。關(guān)于目標(biāo)器官中毒性作用外觀的信息也可用于選擇適當(dāng)?shù)娜訒r(shí)間。

組織收集：因?yàn)樗梢匝芯空T導(dǎo)的DNA鏈斷裂(彗星)在任何組織中,組織選擇應(yīng)清晰、基于收集的原因進(jìn)行研究與任何現(xiàn)有的基因毒性、致癌性或其他測(cè)試物質(zhì)的毒性數(shù)據(jù)在調(diào)查之中。應(yīng)考慮的重要因素應(yīng)包括給藥途徑、預(yù)測(cè)的組織分布和吸收、代謝的作用以及試驗(yàn)物質(zhì)可能的作用機(jī)制。肝臟是研究頻繁、數(shù)據(jù)feng富的組織。因此，在缺乏任何背景信息的情況下，如果沒有確定感興趣的特定組織，那么對(duì)肝臟進(jìn)行取樣是合理的，因?yàn)楦闻K是異種生物代謝的主要場(chǎng)所，而且常常高度暴露于母體物質(zhì)和代謝物中。在某些情況下，直接接觸部位的檢查(例如，口服藥物，胃腺或十二指腸/空腸，或吸入藥物，肺)可能是相guan的。應(yīng)根據(jù)進(jìn)行測(cè)試的具體原因選擇其他或替代組織，但如果實(shí)驗(yàn)室已證明對(duì)這些組織的熟練程度和同時(shí)處理多個(gè)組織的能力，對(duì)同一動(dòng)物的多個(gè)組織進(jìn)行檢查可能是有用的。

樣本制備：在后一次用測(cè)試化學(xué)品后的適當(dāng)時(shí)間，對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂。收集選定的組織,而同時(shí)采集同一組織的一部分,放置在甲醛溶液或適當(dāng)?shù)墓潭▌┛赡芙M織病理學(xué)分析。彗星實(shí)驗(yàn)的組織被放置在切碎緩沖液中，用冷切碎緩沖液充分沖洗以去除殘留的血液，并儲(chǔ)存在冰冷的切碎緩沖液中，直到處理完畢。原位灌注也可進(jìn)行，如肝、腎灌注。

玻片準(zhǔn)備：單細(xì)胞懸液制備后，應(yīng)盡快(hao在1小時(shí)內(nèi))制備載玻片，但動(dòng)物死亡與載玻片制備之間的溫度和時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制，并在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行驗(yàn)證。向低熔點(diǎn)瓊脂糖(通常0.5-1.0%)中加入細(xì)胞懸浮液的體積，使玻片的低熔點(diǎn)瓊脂糖百分比不應(yīng)降低到0.45%以下。jia的細(xì)胞密度將由用來(lái)給彗星評(píng)分的圖像分析系統(tǒng)決定。

細(xì)胞裂解：裂解條件也是一個(gè)關(guān)鍵變量，可能會(huì)干擾特定類型的DNA修飾(某些DNA烷基化和堿基內(nèi)收)導(dǎo)致的鏈斷裂。因此，我們建議在實(shí)驗(yàn)中對(duì)所有玻片的裂解條件盡可能保持恒定。準(zhǔn)備好后，應(yīng)在約2-8攝氏度的弱光條件下(如黃光(或防光)，將載玻片浸入冷凍溶解液中至少1小時(shí)(或過(guò)夜)，以避免暴露在可能含有紫外線成分的白光下。在此潛伏期之后，在堿液展開步驟之前，應(yīng)沖洗載玻片以除去殘留的洗滌劑和鹽。這可以用純凈水、中和緩沖液或磷酸鹽緩沖液來(lái)完成。也可以使用電泳緩沖液。這將維持電泳室的堿性條件。

解旋和電泳：將載玻片隨機(jī)放置在含有足夠電泳溶液的潛電泳裝置的平臺(tái)上，使載玻片表面*覆蓋(每次覆蓋的深度也應(yīng)一致)。在其他類型的彗星試驗(yàn)電泳裝置，即主動(dòng)冷卻，循環(huán)和高容量電源，較高的解決方案覆蓋將導(dǎo)致更高的電流，而電壓保持不變。在電泳槽內(nèi)放置載玻片應(yīng)采用平衡設(shè)計(jì)，以減輕槽內(nèi)任何趨勢(shì)或邊緣效應(yīng)的影響，并盡量減少批與批之間的差異，即，在每次電泳中，研究中每個(gè)動(dòng)物的載玻片數(shù)量應(yīng)相同，并應(yīng)包括來(lái)自不同劑量組(陰性和陽(yáng)性對(duì)照)的樣本。應(yīng)該留給DNA解旋至少20分鐘,然后進(jìn)行電泳受控條件下,測(cè)定的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍da化(即導(dǎo)致尾部DNA百分比的可接受水平的正面和負(fù)面的控制靈敏度da化)。DNA遷移水平與電泳時(shí)間線性相關(guān)，也與電位(V/cm)線性相關(guān)。根據(jù)JaCVAM試驗(yàn)，這可能是0.7 V/cm，持續(xù)至少20分鐘。電泳時(shí)間被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵的變量，需要設(shè)置電泳時(shí)間來(lái)優(yōu)化動(dòng)態(tài)范圍。較長(zhǎng)的電泳時(shí)間(如30或40分鐘，以提高靈敏度)通常會(huì)導(dǎo)致較強(qiáng)的陽(yáng)性反應(yīng)已知的誘變。然而，較長(zhǎng)的電泳時(shí)間也可能導(dǎo)致過(guò)度遷移的控制樣本。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，電壓應(yīng)保持恒定，其他參數(shù)的變異性應(yīng)在一個(gè)較窄的指ding范圍內(nèi)。調(diào)節(jié)緩沖深度，達(dá)到要求，并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持。應(yīng)記錄電泳開始和結(jié)束時(shí)的電流。因此，jia條件應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室中與所研究的每個(gè)組織有關(guān)的熟練程度的初步演示期間確定。通過(guò)展開和電泳的電泳溶液的溫度應(yīng)保持在低溫下，通常為2-10oC(10)。

電泳完成后，將載玻片在中和緩沖液中浸泡/沖洗至少5分鐘。凝膠可以被染色并標(biāo)記為“新鮮”(例如在1-2天內(nèi))，也可以被脫水以便以后的標(biāo)記(例如在染色后1-2周內(nèi))。但是，這些條件應(yīng)該在熟練程度的展示過(guò)程中得到驗(yàn)證，并且應(yīng)該為每個(gè)條件分別獲得和保留歷史數(shù)據(jù)。如果是后者，則應(yīng)將玻片浸入無(wú)水乙醇中脫水至少5分鐘，風(fēng)干，然后儲(chǔ)存在室溫或冰箱容器中。

測(cè)量方法：彗星應(yīng)該使用自動(dòng)化或半自動(dòng)化的圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量評(píng)分。用合適的熒光染色劑對(duì)載玻片進(jìn)行染色，并在配備有超熒光和適當(dāng)檢測(cè)器的顯微鏡或數(shù)碼相機(jī)上進(jìn)行適當(dāng)放大(如200x)的測(cè)量。

根據(jù)彗星圖像圖譜的描述，細(xì)胞可以分為三種類型，即可分析、不可分析和“刺猬。只有可分析的細(xì)胞(明確定義的頭部和尾部，不干擾相鄰的細(xì)胞)應(yīng)該為%的尾部DNA，以避免人為干擾。刺猬的頻率應(yīng)該根據(jù)每個(gè)樣本至少150個(gè)細(xì)胞的視覺評(píng)分(因?yàn)槿鄙僖粋€(gè)清晰定義的頭部意味著它們不容易被圖像分析檢測(cè)到)來(lái)確定，并單獨(dú)記錄下來(lái)。

所有用于分析的玻片，包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照的玻片，都應(yīng)獨(dú)立編碼并進(jìn)行“盲法”評(píng)分，以便評(píng)分者不知道情況。對(duì)于每個(gè)樣本(每個(gè)動(dòng)物的每個(gè)組織)，至少應(yīng)該分析150個(gè)細(xì)胞(刺猬除外)。分析150細(xì)胞/動(dòng)物至少5動(dòng)物每劑，提供足夠的統(tǒng)計(jì)能力。

彗星DNA鏈斷裂可以通過(guò)尾DNA %、尾長(zhǎng)和尾力矩等獨(dú)立端點(diǎn)來(lái)測(cè)量。如果使用適當(dāng)?shù)膱D像軟件分析儀系統(tǒng)，就可以進(jìn)行這三種測(cè)量。然而，推薦將%尾DNA(也稱為%尾強(qiáng)度)用于結(jié)果的評(píng)估和解釋，并由以細(xì)胞總強(qiáng)度百分比表示的尾DNA的片段強(qiáng)度決定。

數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷

在實(shí)驗(yàn)條件下，陽(yáng)性對(duì)照組的尾DNA%的與陰性對(duì)照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的增加（p<0.05）時(shí)，判定試驗(yàn)系統(tǒng)有效。

在試驗(yàn)系統(tǒng)判定有效的前提下，同時(shí)滿足以下三個(gè)條件，則判定受試樣品為陽(yáng)性結(jié)果：

（1） 尾DNA%的在某個(gè)單獨(dú)劑量組顯著升高；

（2） 尾DNA%隨試驗(yàn)樣品濃度升高有顯著增加趨勢(shì)；

（3） 受試物組的尾DNA%全部超過(guò)陰性背景數(shù)據(jù)范圍。

在判定陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，如僅符合上述標(biāo)準(zhǔn)中的一個(gè)或兩個(gè)，除統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，還應(yīng)考慮其生物學(xué)意義。

如全部不符合上述3個(gè)，則判定為陰性結(jié)果。

試驗(yàn)報(bào)告

試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容：

（1）受試物來(lái)源如批號(hào)；

（2）測(cè)試化學(xué)品的穩(wěn)定性、使用限制日期或已知的重新分析日期;

（3）化學(xué)識(shí)別，如IUPAC或CAS名稱、CAS編號(hào)、SMILES或InChI代碼、結(jié)構(gòu)公式、純度、雜質(zhì)的化學(xué)識(shí)別(視情況和實(shí)際可行)等。

（4）多組分物質(zhì)，UVBCs和混合物, 盡可能用化學(xué)特性(見上文)、定量發(fā)生和表征化學(xué)成分的相關(guān)理化性質(zhì)。

（5）溶劑選擇的理由，已知測(cè)試化學(xué)品在溶劑/溶媒中的溶解性和穩(wěn)定性;劑量制劑的制備;對(duì)配方(例如穩(wěn)定性、均勻性、名義濃度)的分析測(cè)定;

（6）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：所使用的品種，以及作出選擇的科學(xué)和倫理理由;動(dòng)物的數(shù)目、年齡和性別;來(lái)源、居住條件、飲食、營(yíng)養(yǎng)等;試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)動(dòng)物的體重，包括每組動(dòng)物體重的范圍、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差;

（7）測(cè)試條件：陽(yáng)性和陰性控制數(shù)據(jù);測(cè)距研究的結(jié)果(如進(jìn)行);劑量水平選擇的理由;測(cè)試化學(xué)制劑的詳細(xì)資料;測(cè)試化學(xué)品的管理詳情;行政路線的基本原理;注射部位(用于皮下或靜脈注射研究);樣品制備方法，如有，組織病理學(xué)分析，特別是對(duì)彗星反應(yīng)陽(yáng)性的物質(zhì);

（8組織選擇的基本原理;

如果檢測(cè)結(jié)果為陰性，則驗(yàn)證該測(cè)試化學(xué)品是否達(dá)到目標(biāo)組織或一般循環(huán)的方法;

根據(jù)膳食/飲用水試驗(yàn)化學(xué)濃度(ppm)和消耗量(如適用)計(jì)算的實(shí)際劑量(mg/kg體重/日);

飲食及水質(zhì)詳情;詳細(xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)方案和取樣計(jì)劃以及選擇的理由(如有毒物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù));-止痛、鎮(zhèn)痛方法;-安樂的方法;分離和保存組織的程序;制備單細(xì)胞懸液的方法;所有試劑的來(lái)源和批號(hào)(如有可能);評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的方法;電泳條件;使用染色技術(shù)；評(píng)價(jià)和測(cè)量彗星的方法;

（9）結(jié)果:對(duì)每只動(dòng)物在試驗(yàn)前和整個(gè)試驗(yàn)期間進(jìn)行一般臨床觀察(如有);進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)的證據(jù);超過(guò)一周的研究:研究期間的個(gè)體體重，包括各組體重范圍、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差; 劑量-反應(yīng)關(guān)系明顯;對(duì)于每個(gè)組織/動(dòng)物，%的尾部DNA(或其他測(cè)量方法，如果選擇)和每張玻片的中位數(shù)，每只動(dòng)物的平均值和每組的平均值;同步和歷史陰性對(duì)照數(shù)據(jù)，包括評(píng)估的每個(gè)組織的范圍、平均值/中位數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差;并發(fā)和歷史正控制數(shù)據(jù);對(duì)于肝臟以外的組織，使用陽(yáng)性對(duì)照的劑量-反應(yīng)曲線。

（10）應(yīng)用的統(tǒng)計(jì)分析和方法; 

（11）討論結(jié)果和結(jié)論

彗星試驗(yàn)試劑盒

北京匯智泰康針對(duì)堿性彗星試驗(yàn)開發(fā)彗星試驗(yàn)試劑盒，本試劑盒提供了彗星試驗(yàn)（單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)）需要的主要試劑盒耗材，省去了細(xì)胞裂解液、細(xì)胞懸液、堿性電泳液、電溶膠配制等時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期；試劑盒各成分均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)和多次試驗(yàn)驗(yàn)證，符合堿性彗星試驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。

堿性彗星試劑盒應(yīng)用廣泛，可進(jìn)行食品與飲用水、化學(xué)品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個(gè)方面的遺傳毒性檢測(cè)評(píng)價(jià)。

【產(chǎn)品說(shuō)明】

  本試劑盒提供了單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（single cell gel electrophoresis,SCGE）需要的試劑和耗材。

• 細(xì)胞裂解液避免了多成分配制的繁瑣工藝，保證了每次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞裂解的穩(wěn)定性。
• 電泳膠經(jīng)過(guò)采用先進(jìn)工藝規(guī)?；苽?，出廠前經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)時(shí)直接溶解即可使用。
• 針對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩孔式玻片增加了溶膠的粘附性，使細(xì)胞完整，便于拍照分析。

【試劑盒應(yīng)用范圍】

本試劑盒應(yīng)用范圍非常廣，可進(jìn)行食品與飲用水、化學(xué)品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝 材料等遺傳毒理學(xué)檢測(cè)。

【傳統(tǒng)試驗(yàn)操作不足】

• 溶液配制繁瑣，每次配制裂解效果不同。
• 不同膠濃度會(huì)影響DNA尾百分?jǐn)?shù)，過(guò)低濃度的膠穩(wěn)定性差，過(guò)高濃度的膠會(huì)抑制彗星尾的產(chǎn)生，且反復(fù)溶膠會(huì)導(dǎo)致儲(chǔ)備液蒸發(fā)，影響試驗(yàn)結(jié)果。
• 傳統(tǒng)玻片對(duì)溶膠的粘附性較低，且溶膠易流出玻片，損失較大。

【試劑盒優(yōu)勢(shì)】

便捷—— 本試劑盒省去了裂解液配制時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。

準(zhǔn)確——本試劑盒各成分均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。

穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強(qiáng)、易于運(yùn)輸和保存。

【產(chǎn)品使用說(shuō)明】

儀器和設(shè)備

干熱烤箱、低溫冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、雙穩(wěn)定電泳儀、電泳槽、倒置熒光顯微鏡和低速冷凍離心機(jī)等。

試劑配制

實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)根據(jù)說(shuō)明書要求自行準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需試劑及耗材。   

注：可根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際需求改變?cè)噭┑呐渲屏俊?/font>

單細(xì)胞懸液制備

（1）懸浮細(xì)胞：細(xì)胞懸浮液經(jīng)離心分離獲得。將細(xì)胞以1×10⁵個(gè)/ml的速度懸浮于1X PBS(不含Ca+和Mg+)中。

（2）貼壁細(xì)胞：輕輕從皿底分離細(xì)胞。將細(xì)胞和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到離心管中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用1X PBS (不含Ca+和Mg+)冰洗一次。將細(xì)胞以1×10⁵個(gè)/ml的速度懸浮于1X PBS(不含Ca+和Mg+)中。

（3）組織制備：稱取組織約0.05 g，加入制備緩沖液（含20 mmol/L EDTA-Na2的PBS）立即剪碎，沖洗。迅速研磨組織，過(guò)濾，整個(gè)過(guò)程在冰上操作。離心重懸，計(jì)數(shù)單細(xì)胞懸液密度約在為1×10⁵～4×10⁵個(gè)/mL。

制片、裂解、解旋及電泳

（1）取120μL濃度為電泳膠A趁熱鋪于磨砂載玻片上，形成底膠，用蓋玻片推勻，不能有氣泡，4℃凝固20min。

（2）水平取下蓋片，取80 μL電泳膠B與20μl細(xì)胞懸液混勻，立即鋪片，加上蓋玻片，4℃凝固5min，形成第二層膠。再取80μL電泳膠B鋪在第二層膠上，4℃凝固5min，形成第三層膠。保證細(xì)胞均勻分布于每孔，每個(gè)樣本平行2孔。

（3）細(xì)胞裂解

將玻片置于平皿中，加入預(yù)冷的裂解液（裂解液：DMSO=10:1），4℃過(guò)夜裂解，裂解液平面剛好沒過(guò)玻片表面。裂解后，倒掉裂解液，用超純水清洗3次，5min/次。

4、解旋

加入預(yù)冷的解旋液（pH＞13）沒過(guò)玻片，4℃避光解旋1h。

5、電泳

預(yù)先將電泳槽置于冰盒內(nèi)，冷卻備用。將解璇后的細(xì)胞玻片置于電泳槽，倒入電泳液，調(diào)整電壓 22-24V，電流約為300Ma，電泳20min。電泳結(jié)束后，取出玻片，輕輕擦拭，去除多余液體。

超純水清洗2遍，無(wú)水乙醇脫水1遍，5min/次。37℃烘干。

染色、拍照及分析

染色時(shí)將稀釋過(guò)的Gene Red : Tris-Hcl 1:6000，加到玻片每孔表面，每孔100μL，避光染色30分鐘。超純水清洗3遍，去除多余液體，37℃烘干或室溫避光晾干。

拍照前關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室光源，使用CASP1.2.3beta2彗星圖像分析軟件進(jìn)行分析，每只動(dòng)物都要分析150個(gè)可分析的尾DNA含量百分率的中位數(shù)。分析過(guò)程中如遇刺猬細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。

【注意事項(xiàng)】

1.本試劑盒僅供科研使用，不可用于診斷程序。

2.實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)自行準(zhǔn)備DMSO、超純水、手術(shù)器械、篩網(wǎng)、無(wú)水乙醇、染色液、水平電泳槽等。

3.使用組織進(jìn)行彗星試驗(yàn)時(shí)，需注意細(xì)胞制備需全程在冰上進(jìn)行，且保證在1 h內(nèi)完成鋪片。

4.電泳膠使用時(shí)需提前水浴融化，禁用微波。

5.因各實(shí)驗(yàn)室條件不同，各種激發(fā)光源所需染色液各異，本試劑盒未提供染色液。推薦的染色液包括但不局限于Gene Red、SYBR Green、SYBR Gold等。

6.清洗玻片時(shí)注意不要直接將液體傾倒至膠面，防止脫膠。

圖1 陽(yáng)性對(duì)照                                     圖2 陰性對(duì)照

注：附圖僅供參考，以實(shí)際為準(zhǔn)。

常見問(wèn)題及原因分析

1. 大鼠麻醉處死后，取肝臟樣品制備要注意肝的保存溫度及保存時(shí)間、冷凍組織以及一些其他諸如取樣所用緩沖溶液、所取肝臟組織大小等因素。取好的肝臟在制成單細(xì)胞懸液前多在冰上保存1h。一半彗星實(shí)驗(yàn)所取的肝臟大小約為0.05cm³。

2. 如需將組織冷凍，應(yīng)將組織取出后迅速并深度冷凍，直至制備單細(xì)胞懸液時(shí)取出。

3. 解旋時(shí)間會(huì)影響DNA尾百分?jǐn)?shù)，DNA尾百分?jǐn)?shù)隨著解旋時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)。

4. 電泳時(shí)間會(huì)影響DNA尾百分?jǐn)?shù)，細(xì)胞DNA遷移隨著電泳時(shí)間的增長(zhǎng)二增長(zhǎng)?？梢酝ㄟ^(guò)改變電壓提高試驗(yàn)的靈敏度，推薦電壓為0.7V/cm。

5. 如有其他技術(shù)問(wèn)題，可聯(lián)系匯智泰康。